在现代医学的飞速发展中，抗体偶联药物（ADC）作为一种革命性的靶向治疗手段，正深刻改变着癌症患者的治疗前景。与传统化疗的广谱杀伤不同，ADC能够精准识别并攻击肿瘤细胞，最大限度地保护健康组织，从而显著提升治疗效果并降低副作用。全球范围内，已有17款ADC药物获批上市，另有超过200款创新ADC正处于临床研究阶段，预示着未来将有更多突破性疗法惠及广大癌症患者。对于寻求这些前沿靶向药的患者，了解其作用机制和获取途径至关重要。
ADC的成功并非偶然，其精妙设计涉及多个关键要素：特异性抗体、连接子、细胞毒性有效载荷的选择、药物附着位点以及药物抗体比（DAR）。其中，药物与抗体的偶联方式尤为关键，它直接影响着ADC的稳定性、治疗效果和药代动力学特性。深入理解这些设计原理，有助于我们更好地评估不同靶向药的潜力。
ADC的偶联技术是其核心所在，主要分为两大类：随机偶联和位点特异性偶联。更细致地划分，可分为三类：随机偶联（如随机赖氨酸偶联），其特点是操作相对简便；位点特异性但非位点选择性偶联，包括酶偶联、聚糖偶联、亲和肽偶联以及链间半胱氨酸偶联，这些方法在一定程度上提升了均一性；以及最先进的位点特异性且位点选择性偶联，通过修饰氨基酸序列（如工程半胱氨酸或非天然氨基酸）来提供精确的结合位点。虽然随机偶联和链间半胱氨酸偶联在化学制造和控制（CMC）方面相对简单，但位点特异性偶联技术能带来更好的药物均一性，但也可能面临蛋白质表达、纯化和质量控制等方面的挑战。这些技术进步共同推动了抗癌资讯的不断更新。
随机偶联：赖氨酸偶联技术
赖氨酸偶联作为一种历史悠久且成熟的ADC生产技术，其原理是利用抗体赖氨酸残基上约40个可溶剂接触的氨基（NH2基团），这些基团在中性溶液中表现出高度亲核性。亲电试剂能够精准靶向这些氨基，使连接子-有效载荷复合物附着到抗体上，同时不改变抗体本身的结构。目前，已有五款商业化ADC药物成功采用了赖氨酸偶联技术，充分证明了其有效性。
受此成功启发，研究人员开发了多种新型连接子，如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及其衍生物、苯甲酰氟、异硫氰酸酯和方酸甲酯。然而，这些连接子的高反应性也带来挑战，它们可能在水溶液中被淬灭，NHS酯的水解便是影响连接子-有效载荷（LP）偶联效率的关键因素之一。此外，反应性较低的连接子在温和条件下与半胱氨酸的硫醇基团（-SH）反应较快，而与赖氨酸的反应则相对缓慢。
尽管存在这些挑战，赖氨酸偶联依然是生产化学稳定且可重复ADC产品的可靠方法。随着位点特异性结合技术的不断发展，赖氨酸偶联在提升药物均一性方面的潜力也持续增强，为创新靶向药的研发奠定基础。
位点特异性但非位点选择性偶联
链间半胱氨酸偶联
链间半胱氨酸偶联是ADC领域广泛应用的技术。IgG1抗体通常在溶剂暴露区域拥有四对链间二硫键。通过还原剂（如三（2-羧乙基）膦TCEP和DL-二硫苏糖醇DTT）处理后，这些二硫键会断裂，产生八个游离硫醇基团。相较于赖氨酸残基上的SN2反应，硫醇作为亲核试剂更为“柔软”，更易发生迈克尔加成反应。这一特性使得马来酰亚胺及其类似物成为理想的连接子，能够形成稳定且几乎定量的巯基丁二酰亚胺。这种生物正交化学方法非常适合抗体修饰，可以产生携带0、2、4、6或8个有效载荷的ADC变体。
由于硫醇基团数量少于赖氨酸，半胱氨酸介导的ADC异质性远低于赖氨酸偶联。马来酰亚胺偶联物因其操作简便、条件可控和高产率等优势，在众多偶联方法中脱颖而出。截至目前，马来酰亚胺与还原链间二硫化物结合仍是构建ADC的主流方法。在15款已商业化的强效毒性有效载荷ADC中，有10款以及大多数处于临床阶段的ADC均采用了马来酰亚胺偶联技术。
然而，马来酰亚胺-硫醇偶联物存在一个挑战：易发生逆迈克尔加成反应，导致有效载荷在血清蛋白相互作用下过早释放。这种不稳定性会影响ADC在血浆中的药效和安全性。为克服此问题，科学家们积极探索多种策略，包括引入N-芳基和邻氨基等额外基团以催化马来酰亚胺水解，或使用开环马来酰亚胺甲酯来避免逆迈克尔加成反应。此外，KTHIOL™、P5™和溴乙酰氨基癸酰基等新型连接子也展现出增强的硫醇选择性和对逆迈克尔加成反应的抵抗力，这些创新为癌症治疗带来了新的希望。
酶标签偶联
酶偶联技术通过利用能识别特定氨基酸序列的酶，将有效载荷精准地附着到抗体上，从而在ADC生产中实现高均一性。这种方法展现了其作为高效偶联技术的巨大潜力。许多酶偶联策略需要对氨基酸序列进行工程改造，以适应抗体等底物的结构。
目前临床上应用的酶包括：
- Sortase A (SrtA)：一种30 kDa的转肽酶，能切割LPXTG序列形成硫酯酰基酶中间体，将肽LPXT转移到底物的N端。例如，处于1/2期试验阶段的NBE-002（SMAC Technology™）就采用了此技术。
- 甲酰甘氨酸生成酶：附着在CXPXR序列上，将半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸。采用此偶联方法的ADC如TRPH-222（SMARtag™），目前处于1期临床阶段。
- 法尼烷基转移酶：通过在CaaX标签内的半胱氨酸残基上添加类异戊二烯基团来修饰抗体。例如，FS-1502（ConjuAll™）已进入III期临床阶段。
- 微生物转谷氨酰胺酶（mTG）：靶向抗体上的天然位点（如Q295位点），催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺与有效载荷的游离胺基之间形成酰胺键。代表性分子DP303目前也处于III期临床。
此外，肽天冬酰胺基连接酶、微管蛋白酪氨酸连接酶等多种酶也正应用于临床前研究阶段的ADC开发。
尽管酶偶联技术在临床前和临床阶段取得了显著成功，但其过程通常比传统技术更为复杂，需要更广泛的材料和更精细的步骤，这可能影响生产成本和成功率。同时，酶偶联会引入结合酶、辅因子和表达相关杂质等额外成分，这些都可能具有潜在的免疫原性，因此需要额外的纯化步骤来确保最终产品的纯净度。总而言之，酶偶联是一种强大的位点特异性技术，未来通过技术更新和CMC工艺优化，有望进一步提升产品的均一性，为癌症靶向药的获取提供更多选择。
聚糖重塑偶联
在过去十年中，聚糖偶联技术在学术界和工业界引起了广泛关注。尽管大多数聚糖偶联方法仍需酶的辅助，但它们的一大优势在于无需进行氨基酸序列工程。早期技术通过高碘酸钠（NaIO4）氧化聚糖上的顺式二醇，生成醛基以进行后续修饰。而近期策略则更侧重于聚糖重塑，即对附着在N297位点的天然聚糖进行修饰或替换，使其能与功能性连接子或连接子-载荷复合物偶联。
以Synaffix的GlycoConnect™技术为例，它利用内切糖苷酶修剪天然聚糖异构体，随后添加叠氮修饰的半乳糖残基和半乳糖基转移酶。这种经过修饰的聚糖再通过点击化学与有效载荷偶联。该方法在ADC开发中应用广泛，已有六个活跃的临床阶段项目（包括IBI-343）采用了此技术。然而，此过程涉及至少两种酶和三个偶联步骤，可能增加开发的复杂性、降低产量并提高CMC成本。
此外，从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，能够水解IgG的N-聚糖，使水解后的残基成为生物偶联的有效位点，从而在单个偶联步骤中将靶分子附着到N297位点。这种方法不仅有助于使单克隆抗体的聚糖结构均匀化，还适用于任何IgG亚型。尽管EndoS2方法尚未经过临床验证，但其在降低CMC成本方面的潜力使其极具吸引力，有望为海外靶向药代购提供更多高效选择。
亲和肽偶联
亲和肽偶联是一种利用蛋白A或G IgG结合位点衍生的亲和肽进行定向偶联的技术。这些亲和肽能够选择性地结合抗体Fc区的特定位点，使连接子更接近某些赖氨酸残基，从而加速连接子与氨基（-NH2）基团的反应。为避免与其他反应性氨基发生副反应，通常需要使用温和的连接子。
典型的结合位点位于Fc区的K248/K288或K337残基附近。尽管通过序列修饰可以将亲和肽的结合位点转移到Fab区，但这通常会导致结合效率的下降。一些创新方法涉及将连接子通过稳定的共价键偶联到亲和肽上，然后再共价连接到抗体，最终形成ADC。然而，需要注意的是，大型非天然肽可能会通过阻碍FcRn结合来干扰Fc功能，进而可能降低ADC的内化效率。对于关注靶向治疗最新进展的患者，了解这些偶联技术的细节有助于更好地理解药物作用。
位点特异性且位点选择性偶联
工程化半胱氨酸
与利用抗体天然半胱氨酸残基的随机半胱氨酸偶联和重桥接技术不同，工程化半胱氨酸（ThioMab）技术通过引入不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，实现了抗体上所需位点的选择性和均匀修饰。这种半胱氨酸突变的设计旨在促进细胞毒性有效载荷的偶联，同时确保单克隆抗体的稳定性、亲和力，并最大程度地减少ADC聚集。为确定最佳突变位置，研究人员通常会采用计算建模、模型系统筛选和高通量扫描等多种技术。
Junutula及其团队首次报道了硫单抗策略，他们用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC-A114C）。这一工程化位点上的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子发生反应。实验结果显示，合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出显著效力，并在大鼠和食蟹猴中展现出高剂量耐受性，从而确立了硫单抗偶联策略的通用性。
下表详细列出了临床阶段ADC中使用的工程化半胱氨酸位点，这些技术正推动着靶向药的精准化发展。
非标准氨基酸偶联
除了工程化半胱氨酸技术，非标准氨基酸（ncAA）的引入为位点特异性偶联提供了又一创新途径。这项技术利用具有独特化学结构的氨基酸，以化学选择性的方式将连接子-有效载荷复合物引入抗体。该技术需要对抗体序列进行重组，并利用与宿主细胞内源性tRNAs和氨酰tRNA合成酶（aaRS）正交的tRNA和aaRS系统，以响应未赋值密码子将ncAA整合到蛋白质中。通常，ncAA会在发酵过程中添加到培养基中。在选择非天然氨基酸时，必须谨慎考虑其潜在的免疫原性。常用的ncAA是天然氨基酸的类似物，它们带有独特的基团，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。
研究已成功将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）整合到抗CXCR4抗体中，并通过肟连接将有效载荷Auristin有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内展现出良好的体外活性，并能完全清除肺部肿瘤。
考虑到肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种策略是引入含有ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）能够在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应。利用此策略，研究人员成功地将糖皮质激素有效载荷偶联到抗CD74抗体上。除了pAcF技术，含有叠氮的赖氨酸类似物（AzK）也成功整合到抗体中，用于生产带有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。
此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及天然存在的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec），也已成功整合到抗体中。这些生成的ADC均表现出良好的稳定性、选择性以及优异的体外和体内活性，为癌症创新药的开发提供了广阔前景。
结语：ADC偶联技术的未来展望
偶联技术对抗体偶联药物（ADC）的特性具有深远影响，包括其结合能力、内化效率、有效载荷释放、药代动力学（PK）以及效应器功能等。因此，为特定的抗体/连接子-有效载荷组合确定最佳偶联位点和化学方法，仍然是当前面临的重大挑战。
尽管新兴的偶联技术在理论上展现出更好的疗效和安全性，但从临床前研究到临床应用的转化过程中，仍常存在一定差距。此外，即使某些新偶联技术看似简化了流程，但在化学制造和控制（CMC）环节，它们也可能带来意想不到的挑战。
随着我们对ADC复杂性的理解不断加深，以及更多采用先进偶联方法的ADC积累了丰富的临床数据，我们有理由期待未来将涌现出更多创新且更适用的偶联技术。这些持续的技术进步将进一步满足癌症治疗中尚未被满足的临床需求，为全球癌症患者带来更多生的希望。如果您正在寻找这些前沿的靶向药，MedFind致力于提供专业的海外购药服务，助您获取最新的治疗方案。
