在与癌症抗争的漫长旅程中，每一次科技的突破都为患者带来了新的希望。近年来，免疫疗法的兴起彻底改变了癌症治疗的格局，但并非所有患者都能从中获益。为了更深入地理解肿瘤的复杂性，并为更多患者找到有效的治疗方案，单细胞分析、人工智能（AI）与肿瘤免疫组学等前沿技术正发挥着举足轻重的作用，共同开启了癌症精准治疗的新篇章。
一、肿瘤免疫微环境：癌症的复杂生态系统
过去，我们对肿瘤的认识主要停留在癌细胞本身。然而，随着研究的深入，肿瘤被重新定义为一个复杂的“器官样结构”，它不仅仅包含癌细胞，还包括免疫细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及其他基质细胞。这些细胞和周围环境共同构成了肿瘤免疫微环境（TME），它在癌症的发生、发展、转移和复发中扮演着决定性的角色。
TME中包含着极其多样化的免疫细胞亚群，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC）等。这些细胞的功能并非一成不变，它们与肿瘤细胞的复杂互动可能导致其作用发生动态变化，甚至截然相反。因此，要全面理解肿瘤的免疫学特征，并为免疫疗法提供更精准的指导，就必须借助最先进的生物信息学技术进行系统性分析。
二、NGS时代：深度解析免疫基因组
下一代测序（NGS）技术的飞速发展，如全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq），为我们获取海量基因组和转录组数据奠定了基础，从而能够深入研究多步骤的免疫应答过程。
量化TME中的免疫细胞
传统方法如流式细胞术和免疫组织化学（IHC）在定量TME中的免疫细胞组分时，面临成本高昂和组织样本有限的挑战。NGS技术则通过计算方法，能够从DNA和RNA测序数据中估算出几十种免疫细胞类型的丰度，这些数据已被证实具有高度可靠性。其中，基于基因集富集分析（GSEA）和逆卷积原理的计算方法，如ESTIMATE、xCell、CIBERSORT、TIMER等，极大地推动了TME细胞组分研究的进展。
肿瘤抗原的鉴定
体细胞DNA突变，包括单核苷酸变异（SNV）、插入和缺失（INDEL），是产生异常抗原（即肿瘤抗原）的主要来源。基因组分析工具包（GATK）等已成为识别这些突变的行业标准。此外，预测人类白细胞抗原（HLA）分型对于识别肿瘤抗原至关重要，因为异常肽需要与HLA结合才能被T细胞识别。目前，PHLAT、HLAreporter、Polysolver等工具在HLA分型方面表现出色。
除了识别异常肽和HLA分型，预测抗原与MHC（主要组织相容性复合体）的结合亲和力是肿瘤抗原预测的下一个关键环节。NetMHC和NetMHCpan等工具在预测肽-MHC-I亲和力方面被广泛应用，而预测MHC-II亲和力则更具挑战性，相关方法仍在不断发展中。
三、单细胞技术：洞察细胞层面的奥秘
尽管NGS技术极大地促进了肿瘤学发展，但批量测序可能因信号稀释而掩盖单个细胞的独特反应，从而错过许多重要的生物学现象。单细胞相关技术的突破，将研究水平从群体层面提升到单细胞层面，彻底改变了我们对肿瘤免疫的理解。
多色流式细胞术与质谱流式细胞术
多色流式细胞术能够通过多参数分析区分不同的免疫细胞亚群，但受限于荧光染料发射光谱的重叠。质谱流式细胞术（CyTOF）则结合了流式细胞仪与质谱仪，使用金属同位素标记抗体，可检测多达40个参数，有效避免了光谱重叠问题，成为肿瘤组织高维免疫分析的精确方法。然而，其处理速度和通量受限，且细胞在检测过程中被破坏，不适用于后续细胞分类。
光谱流式细胞术
光谱流式细胞术是传统流式细胞术的又一进步，它仍使用荧光染料，但通过新型探测器测量全发射光谱，能更好地消除光谱重叠，提高效率，有望取代多色流式细胞术。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）
流式细胞术等技术需要预先确定目标细胞，限制了信息的获取。而单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现，则将单细胞领域推向了新的高度。它不再受预定目标的限制，能够对单个细胞进行无偏多组学分析，从而发现“未知的未知”。scRNA-seq在肿瘤免疫治疗领域已取得了许多有价值的发现和启示。尽管面临技术噪音、细胞分离、灵敏度提升和数据分析等挑战，但其潜力巨大。
四、人工智能赋能：加速肿瘤免疫研究
人工智能（AI）在肿瘤免疫研究中的应用日益广泛，主要体现在以下几个方面：减轻人工识别病理切片上免疫浸润的工作量；提供替代技术识别肉眼难以区分的免疫细胞亚群和空间结构；以及提供非侵入性方法预测患者的TME特征和对免疫治疗的反应。
基于深度学习的肿瘤抗原预测
AI技术极大地提升了肿瘤抗原预测的准确性。除了识别SNV的算法外，新的CN学习工具也被设计用于检测拷贝数变异（CNV）。深度学习模型如EDGE、MARIA和MixMHC2pred等，显著提高了MHC-II预测精度，为肿瘤抗原的精准识别提供了强大支持。
放射组学与计算病理学在肿瘤免疫中的应用
放射组学利用AI技术分析医学影像数据，将其转化为大规模数字信息，用于识别反映免疫浸润的生物标记物，并预测免疫检查点阻断（ICB）治疗患者的反应。
计算病理学（数字病理学）则通过计算分析病理切片图像，深入挖掘免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，以及癌症生物学的关键行为。它使我们能够在细胞或分子水平上理解TME，是研究TME结构与癌症治疗关系的有希望的方法。
五、免疫组学在肿瘤免疫治疗中的应用：走向精准个体化
免疫组学的进步，正直接推动着癌症免疫治疗向更精准、更个体化的方向发展。
识别ICB的生物标志物用于患者分层
PD-L1表达水平曾是预测免疫检查点阻断（ICB）疗效的第一个生物标记物，但其局限性促使研究人员寻找更可靠的替代方案。肿瘤突变负荷（TMB）被证实与接受CTLA-4抑制剂治疗患者的临床生存率密切相关，高TMB通常预示着持久的临床益处。FDA已批准了FoundationOne CDx（F1CDx）和MSK-IMPACT等NGS平台用于评估TMB，并在多种癌症（如非小细胞肺癌）中得到验证。
此外，免疫细胞浸润，特别是肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），在免疫反应中起关键作用。单细胞测序技术被用于鉴定更多免疫细胞亚群，例如，TCF7+记忆样T细胞与抗PD-1治疗后黑色素瘤患者的临床改善相关，而干细胞样TCF1+PD1+T细胞则有助于ICB治疗中的肿瘤控制。这些发现为更理想的治疗和预后生物标志物提供了线索。
ACT治疗中新抗原的预测
过继细胞疗法（ACT）通过回输转基因或扩增的T细胞来增强抗肿瘤免疫。免疫组学在ACT治疗中主要用于识别理想的肿瘤新抗原。尽管新抗原特异性TCR-T细胞尚未广泛应用于临床，但已有病例报告显示，免疫组学预测的肿瘤新抗原在结直肠癌、乳腺癌和胆管癌患者中取得了有效性。高通量新抗原检测技术，如基于trogocytosis的平台，正在克服传统方法的局限性，有望实现高效的新抗原选择。
为个体化肿瘤疫苗选择新抗原
免疫组学方法也广泛应用于个体化肿瘤疫苗的开发。通过分析肿瘤和正常组织的WES和RNA序列，并结合算法（如NetMHCpan）预测有效表位，可以识别用于生成个性化疫苗的新抗原。为了提高新抗原预测的准确性和免疫原性新表位选择的效率，免疫组学技术正不断努力，为提高肿瘤疫苗和过继性细胞治疗的疗效奠定坚实基础。
展望未来：精准抗癌的无限可能
近年来，伴随着免疫组学领域新兴技术的巨大飞跃，我们现在能够以前所未有的深度解析肿瘤免疫。从批量测序时代对肿瘤免疫细胞浸润模式的探索，到异常肽、HLA分型和肿瘤抗原MHC结合亲和力的精准预测，免疫组学技术已在临床前和临床研究中证明了其可靠的功效。
此外，随着单细胞免疫相关技术（从多色流式细胞术到CyTOF）的发展，单细胞肿瘤免疫图谱帮助我们进行免疫细胞亚群分类，以破译复杂的TME成分。人工智能的出现，更是为免疫组学的发展提供了新的方向，加速了研究进程。
尽管这些前沿技术仍面临诸多挑战，如技术噪音、混杂因素、成本效益和可及性等问题，但其巨大的临床价值无疑将极大地促进肿瘤免疫学在免疫组学、单细胞和人工智能领域的发展。未来，我们期待这些技术能更加成熟、普及，最终为全球癌症患者带来更精准、更有效的治疗方案，实现真正的精准医疗。
参考资料：
1.Technological advances in cancer immunity: from immunogenomics to single-cell analysis and artificial intelligence. SignalTransduct Target Ther. 2021; 6: 312.
