引言：CAR-NK细胞疗法的新曙光与挑战
在肿瘤免疫治疗领域，嵌合抗原受体（CAR）技术，特别是CAR-T细胞疗法，已在血液肿瘤治疗中取得了显著成就。而作为先天免疫系统的“急先锋”，天然杀伤（NK）细胞因其强大的抗肿瘤潜力备受关注，基于NK细胞的CAR-NK细胞疗法正迅速崛起，成为继CAR-T之后又一备受瞩目的免疫疗法新星。
然而，即便拥有强大潜力，CAR-NK细胞在复杂的肿瘤微环境中也并非一帆风顺。它们常会遭遇“功能疲惫”或“功能失调”的困境，导致抗癌药效力大打折扣。尽管我们对TIGIT、TIM3等表面免疫检查点已有一定了解，但对于那些可能从细胞内部深层调控免疫细胞功能的转录因子，研究仍相对有限。理解这些内在机制，对于开发更高效的靶向药和抗癌药至关重要。
近期，《Nature》杂志发表了一项突破性研究（“CREM is a regulatory checkpoint of CAR and IL-15 signalling in NK cells”），揭示了一个关键的“幕后推手”——CREM（cAMP Response Element Modulator）。这项研究通过对肿瘤小鼠模型中过继转移的CAR-NK细胞进行深入的单细胞转录组分析，意外发现CREM的表达量在CAR-NK细胞发挥效应功能的巅峰期显著升高。更令人费解的是，这种升高既伴随着细胞激活的特征（如颗粒酶B（GZMB）、溶细胞素（GNLY）等抗肿瘤效应基因的上调），也伴随着功能失调的标志（如TIGIT、KLRG1等抑制性检查点基因的升高）。这暗示CREM可能是一个双刃剑，既是激活的伴随，也预示着潜在的疲惫。
进一步的机制探索表明，CAR活化信号和白细胞介素-15（IL-15）刺激都能快速诱导CREM的上调，并且这种诱导通过PKA-CREB信号通路介导。更令人振奋的是，当研究人员通过基因编辑敲除CAR-NK细胞中的CREM时，这些细胞在体外和体内都展现出显著增强的抗肿瘤能力，能够更有效地清除肿瘤，增强对肿瘤诱导的免疫抑制的抵抗力，甚至在动物模型中延长了生存期。这一发现不仅为我们深入理解NK细胞功能提供了新的视角，更指明了通过靶向CREM来提升CAR-NK细胞疗效的潜在新策略，为攻克癌症带来了新的希望。
CREM的意外发现：免疫细胞的“疲惫开关”
这项研究始于一个核心疑问：当CAR-NK细胞执行抗肿瘤任务时，它们的基因表达会发生怎样的变化？研究人员对输注到淋巴瘤小鼠体内的CAR19-IL-15 NK细胞进行了单细胞转录组数据分析，结果发现，在清除肿瘤的过程中，一个基因的表达量显著升高——那就是CREM。
数据显示，在体内输注后，CAR-NK细胞的CREM表达量显著升高，且这种升高与小鼠体内肿瘤控制的改善呈正相关。这似乎在暗示CREM与CAR-NK细胞的抗肿瘤活性密切相关。然而，深入分析却揭示了其复杂性：这些CREM高表达的CAR-NK细胞，不仅表现出如颗粒酶B（GZMB）和溶细胞素（GNLY）等效应基因的升高，暗示它们正在积极攻击肿瘤，同时也伴随着如TIGIT、KLRG1等抑制性检查点基因的表达上调，这通常与免疫细胞的“疲惫”或功能受损相关。这表明，CREM可能参与了CAR-NK细胞在激活状态下的平衡调控，既有激活的印记，也伴随着功能失调的信号。
为了进一步探究CREM在肿瘤免疫中的普遍性，研究人员分析了来自TISCH2数据库的肿瘤浸润NK细胞（TI-NK）数据。惊人地发现，在多种癌症类型中，TI-NK细胞的CREM表达量普遍高于外周血NK细胞。特别是在膀胱癌、胆管癌和肺癌中，TI-NK细胞的CREM表达量显著增高。更有趣的是，在胰腺癌患者的转移性TI-NK细胞中，CREM的表达量达到了最高水平。这些数据强烈暗示，CREM在肿瘤微环境中的高表达可能与NK细胞的功能受损有关，甚至在某些情况下，高CREM表达与患者不良预后（如低级别胶质瘤、肺腺癌、胃腺癌和乳腺浸润性癌）相关。这进一步强化了CREM作为免疫检查点的潜在角色。
“点火器”的秘密：CAR激活与IL-15如何“点燃”CREM？
既然CREM在NK细胞活化中如此重要，那么它究竟是如何被CAR-NK细胞激活的呢？研究人员深入研究了CAR活化信号和IL-15细胞因子信号对CREM表达的影响。
当CAR-NK细胞与靶抗原（CD70）结合时，CREM的表达量在CAR70 NK细胞中显著升高，明确指出CAR分子内部的ITAM信号在CREM诱导中扮演了关键角色。IL-15作为CAR-NK细胞疗法中常用的促增殖和持久性细胞因子，也展示了其对CREM的强大诱导能力。IL-15能够以剂量依赖的方式显著增加CREM的表达，其诱导强度甚至高于等剂量的IL-2。当CAR激活与IL-15刺激同时存在时，CREM的表达量呈现出叠加效应，这意味着这两种信号通路可以协同作用来诱导CREM。此外，IL-2、IL-12和IL-18以及NK细胞内源性受体的激活，也同样能上调CREM表达。这表明，CREM的上调是NK细胞活化的一个普遍特征，由细胞因子和ITAM信号共同驱动。
机制揭秘：PKA-CREB轴的“幕后推手”
CREM在NK细胞活化中扮演着重要角色，那么其信号通路是怎样的呢？研究深入剖析了CREM诱导的分子机制，揭示了PKA-CREB信号轴的关键作用。当细胞内CAMP水平升高时，蛋白激酶A（PKA）会被激活，进而磷酸化转录因子CREB和CREM。这些磷酸化的转录因子结合到CAMP反应元件（CREs）上，调控靶基因的转录。研究证实，这一经典的PKA-CREB轴在CAR-NK细胞活化中发挥了核心作用。
具体而言，CAR激活能够导致CAR70 NK细胞中CREB的显著磷酸化（pCREB），且这种磷酸化在未转导或缺乏胞内信号域的CAR-NK细胞中不明显。这意味着CAR分子的CD3ζ链信号在诱导pCREB中至关重要。更有力的是，当使用PKA抑制剂H89或钙螯合剂EGTA预处理NK细胞时，CAR诱导的CREB磷酸化和CREM诱导都被强烈抑制了。IL-15同样能以剂量依赖的方式增加PKA活性和pCREB水平，且H89和EGTA也能有效阻断IL-15诱导的CREB磷酸化和CREM表达。这有力支持了PKA-CREB轴在CAR激活和IL-15刺激介导的CREM上调中扮演的关键角色。
研究人员还通过染色质免疫沉淀（ChIP）和定量PCR（qPCR）实验，进一步证实了pCREB能够强烈结合CREM启动子，表明CREM很可能是一个直接被CREB调控的靶基因。值得注意的是，IL-15还通过JAK-STAT通路激活NK细胞，特别是STAT3和STAT5。数据显示，IL-15能够剂量依赖性地增加pSTAT3和pSTAT5。虽然STAT3和STAT5也参与了CREM的诱导，但CREM的诱导在CAR激活后仍能独立于STAT信号发生，主要依赖于PKA-CREB轴。这揭示了CAR-NK细胞中CREM调控的双重机制：通过PKA-CREB信号轴和IL-15下游的STAT3-STAT5通路。
解除“封印”：CREM删除后的CAR-NK细胞威力大增！
既然CREM在NK细胞活化中扮演了复杂的角色，那么，删除CREM是否能提升CAR-NK细胞的抗肿瘤能力呢？研究人员运用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在CAR-NK细胞中特异性敲除了CREM。
在体外实验中，CREM缺失（CREM KO）的CAR-NK细胞展示出显著增强的细胞毒性。无论是长期的二维培养、三维肿瘤球体培养，还是肿瘤再挑战实验中，CREM KO的CAR-NK细胞都表现出更强的杀伤能力。这种增强效应在低效应-靶细胞比率下尤为明显，且无论肿瘤细胞是否表达靶抗原CD70，CREM的缺失都能提升IL-15分泌型NK细胞的效应功能，表明CREM作为IL-15或CAR信号下游的一个通用抑制性检查点。
体外效力的提升在体内模型中得到了更有力的验证。在侵袭性CD70阳性Raji伯基特淋巴瘤小鼠模型中，与野生型CREM CAR-NK细胞相比，接受CREM KO CAR-NK细胞治疗的小鼠肿瘤控制效果显著增强，并最终改善了小鼠的生存率。具体而言，CREM KO组小鼠的肿瘤负担显著降低，生存期显著延长。此外，CREM KO还促进了CAR-NK细胞在外周血以及肝脏、肺、骨髓和脾脏中的增殖和浸润。
在转移性CD70阳性乳腺癌PDX模型中，接受CREM KO CAR-NK细胞治疗的小鼠，其肺部和肝脏的肿瘤负担显著降低，且CAR-NK细胞在这些器官中的增殖和浸润也显著增加。在胰腺癌小鼠模型中，腹腔注射CREM KO CAR-NK细胞也显著改善了肿瘤控制并延长了细胞的体内持久性。
更重要的是，这些增强的抗肿瘤效果并没有以牺牲安全性为代价。在多个小鼠模型中，CREM KO CAR-NK细胞的治疗耐受性良好，小鼠体重保持稳定，且主要器官的组织学分析未显示明显的毒性或异常。这为CREM作为CAR-NK细胞疗法的潜在治疗靶点提供了坚实的证据。
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深度剖析：CREM如何重塑CAR-NK细胞的“命运”？
CREM删除为何能带来如此显著的疗效提升？研究人员通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和转录组测序（RNA-seq）深入探究了CREM对CAR-NK细胞的转录和表观遗传重编程机制。
转录重编程：从“疲惫”到“火力全开”
研究发现，CREM作为一种转录因子，能够直接结合到基因组上的多个位点。在CREM敲除后，CAR-NK细胞的基因表达发生了显著变化。与野生型CREM CAR-NK细胞相比，CREM KO导致了：
- 效应基因的上调：如颗粒酶B（GZMB）和干扰素-γ（IFNG）的表达显著升高，这些是NK细胞执行杀伤功能的核心武器。
- NK细胞发育转录因子的上调：如KLF7和RUNX2，这些因子与NK细胞的成熟和功能密切相关。
- 疲惫和应激相关基因的下调：如BTG1、DUSP2、SMAD3和RGS1，这些基因通常与免疫细胞的功能受损和应激反应有关。
通过基因集富集分析（GSEA），发现CREM敲除显著上调了对NK细胞效应功能和代谢至关重要的通路，包括MYC靶点V1、E2F靶点、MTORC1信号通路和氧化磷酸化。同时，它下调了免疫抑制性通路，如缺氧和TGFβ信号。这些发现共同指向一个结论：CREM通过直接结合并调控基因表达，促进了NK细胞的功能失调和疲惫状态，而CREM的缺失则逆转了这一过程，使CAR-NK细胞能够保持更强的抗肿瘤活性和增殖能力。
表观遗传重编程：解除染色质的“枷锁”
研究人员进一步通过转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）分析了CREM对CAR-NK细胞表观遗传景观的影响。在与肿瘤细胞共培养时，野生型CREM CAR-NK细胞的染色质可及性降低，这表明基因组变得更加“紧密”，不利于基因的表达。然而，CREM KO的CAR-NK细胞即使在肿瘤微环境中，也能够维持更加开放的染色质景观。这意味着CREM的缺失使得与免疫细胞激活、代谢和效应功能相关的关键基因区域更容易被转录机器接触到，从而促进了这些基因的表达。
代谢重编程：更强的“动力引擎”
除了转录和表观遗传的改变，CREM的缺失还显著改善了CAR-NK细胞的代谢健康。通过海马线粒体功能分析（Seahorse assays），发现CREM KO的CAR-NK细胞展示出增强的糖酵解能力，并有增加线粒体呼吸的趋势。这意味着这些细胞拥有了更强的“动力引擎”，能够更有效地产生能量以支持其抗肿瘤功能和持久性。
CREM：CAR-NK疗法的新希望与未来展望
这项开创性的研究首次确立了CREM作为CAR-NK细胞活化中的一个关键转录检查点。它揭示了CAR激活和IL-15信号通过PKA-CREB信号轴共同诱导CREM，而CREM的过度表达则可能导致NK细胞的激活诱导性疲惫。更重要的是，通过基因编辑敲除CREM，成功地“解除”了CAR-NK细胞的“封印”，使其抗肿瘤效力显著增强，且不增加毒性。
这一发现为CAR-NK细胞免疫疗法开辟了全新的策略。未来的研究可以着重于：
- 开发CREM特异性抑制剂：直接靶向CREM或其信号通路，以期在临床上增强CAR-NK细胞的抗肿瘤活性。
- 优化CAR-NK细胞设计：将CREM的敲除或抑制整合到CAR-NK细胞的制备流程中，以期获得更高效、更持久的抗肿瘤细胞产品。
- 深入理解CREM异构体功能：CREM有多种异构体，不同异构体的功能可能存在差异，进一步研究其特异性功能可能带来更精准的调控策略。
CAR-NK细胞疗法正以惊人的速度发展，成为对抗癌症的强大武器。而CREM的发现，如同在迷雾中点亮了一盏明灯，指引我们更深入地理解NK细胞功能调控的复杂机制，并为开发下一代更有效、更安全的CAR-NK细胞疗法提供了崭新的靶点和无限可能。对于希望了解更多前沿抗癌药和靶向药信息，或寻求海外购药途径的患者及家属，MedFind平台提供了全面的抗癌资讯、专业的AI问诊以及便捷的药品代购服务，助力患者获取全球优质医疗资源。
参考文献
Rafei H, Basar R, Acharya S, Hsu YS, Liu P, Zhang D, Bohn T, Liang Q, Mohanty V, Upadhyay R, Li P, Phadatare P, Dede M, Xiong D, Fan H, Jones CM, Kunz S, Daher M, Nunez Cortes AK, Shanley M, Liu B, Moseley SM, Zhang C, Fang D, Banerjee P, Uprety N, Li Y, Shrestha R, Wan X, Shen H, Woods V, Gilbert AL, Rawal S, Dou J, Tan Y, Park JM, Reyes Silva F, Biederstädt A, Kaplan M, Jiang XR, Biederstädt I, Kumar B, Tiberti S, Moore M, Jin J, Yang RZ, Muniz-Feliciano L, Rosemore S, Lin P, Deyter GM, Fowlkes NW, Jain AK, Marin D, Maitra A, Chen K, Bopp T, Shpall EJ, Rezvani K. CREM is a regulatory checkpoint of CAR and IL-15 signalling in NK cells. Nature. 2025 Jun 4. doi: 10.1038/s41586-025-09087-8. Epub ahead of print. PMID: 40468083.
