近年来，双特异性抗体（Bispecific antibody）作为一种革命性的药物形式，正以前所未有的潜力改变着癌症治疗格局。它们能够同时结合两个不同的靶点，实现传统单特异性抗体难以企及的独特功能，例如T细胞接合器和模拟凝血因子VIII的emicizumab等。这种创新疗法为无数癌症患者带来了新的希望。
然而，尽管双特异性抗体在实验室研究中取得了显著成功，但将其大规模商业化生产并转化为临床可用的药物制剂，却面临着巨大的挑战。这些挑战主要体现在表达控制困难、高纯度纯化障碍以及高昂的生产成本上，严重阻碍了其临床转化进程。本文将深入探讨IgG型双特异性抗体链配对技术的发展与最新进展，揭示科学家们如何克服这些难题，加速创新靶向药的问世。
双特异性抗体：复杂结构与早期纯化困境
IgG型双特异性抗体的结构异常复杂，它包含两条不同的重链（分别识别两个靶点）和两条不同的轻链。当细胞同时表达这四种基因时，理论上会产生多达十种可能的组合！然而，其中只有一种是我们期望的正确配对，其余九种都是需要去除的错误配对杂质。更棘手的是，这十种组合在分子量和电荷性质上往往非常接近，使得传统的色谱纯化方法难以有效分离。
面对这一难题，早期的工业化生产尝试主要依赖抗原固定化亲和层析。这种方法通过将双抗结合的两种抗原分别固定在不同的色谱柱上，分步捕获并洗脱目标双抗。虽然理论上可行，但抗原蛋白对碱性条件敏感，导致色谱柱寿命短、再利用率低，从而大幅推高了生产成本，限制了双特异性抗体的广泛应用。
链配对技术的突破性进展
为了实现双特异性抗体的高效生产与纯化，科学家们在抗体工程领域进行了不懈探索，取得了多项关键技术突破。这些技术旨在促进正确的链配对，并简化后续的纯化过程。主要包括：
通用轻链策略
通用轻链技术通过筛选出一个能与两种不同重链良好匹配的轻链，从而减少轻链错配的可能性。这种方法虽然有效，但筛选过程耗时耗力，且通用轻链往往是妥协的产物，可能牺牲部分结合活性或特异性。
等电点（pI）工程
等电点工程利用蛋白质在不同pH值下电荷特性的差异。通过在其中一个重链的可变区引入氨基酸突变，人为地改变目标双抗的等电点，使其与错误配对的杂质产生显著差异。这样，在离子交换色谱柱上，它们就能被有效分离，大大提高了纯化效率。这一步骤通常作为Protein A纯化后的精细纯化手段。
促进重链异源二聚化
确保两个不同的重链优先结合形成异源二聚体是生产双特异性抗体的核心。多种策略已被开发，其中最经典的是“Knobs into Holes”（KiH）技术。该技术通过在两个不同重链的CH3结构域上引入互补突变，使其像齿轮一样精确咬合，从而稳定结合。另一种方法是利用电荷排斥或吸引，例如通过引入带相反电荷的氨基酸对（如E356K和K439E突变），引导正确的重链配对，同时排斥同源重链的结合。
前沿链配对技术平台
基于上述工程策略，研究人员开发了多个先进的链配对技术平台，显著提升了双特异性抗体的可生产性：
FAST-Ig技术
由中外制药开发的FAST-Ig（Favored Assembly by Specific electrostatic interactions for Ig）技术，其核心在于通过精确引入静电相互作用来指导抗体的优选组装。它不依赖通用轻链，而是在重链与轻链、以及重链与重链的结合界面上，巧妙地引入互补的正负电荷氨基酸。这种“静电导航”机制强制正确的链对正确配对，并促进异源二聚体的形成，从而大幅减少错误配对的发生。
CrossMab技术平台
罗氏公司开发的CrossMab技术平台，在KiH方案的基础上，进一步解决了轻链错配问题。该技术不仅在Fc区设计了KiH异源二聚体连接，还巧妙地将Fab区域的CH1和CL结构域互换。通过氨基酸序列的互换，制造出同源区域（如VH与VH、CH1与CH1）之间的空间位阻，从而有效减少轻链的错误配对。CrossMab主要有三种类型：CrossMab-Fab、CrossMab-VH-VL和CrossMab-CH1-CL，分别针对不同区域进行交换以优化配对。
可控Fab臂交换（cFAE）技术
人体内的IgG4抗体具有独特的Fab臂交换能力，这启发了可控Fab臂交换（cFAE）技术的诞生。IgG4的铰链区228位丝氨酸和CH3结构域409位精氨酸的特性，使其在氧化还原条件下能够发生Fab臂交换。cFAE技术的核心在于，通过在两个不同抗体的CH3结构域上引入特定的互补突变（如F405L和K409R），使各自的同源二聚体抗体变得不稳定，在还原剂作用下解离后，它们会更倾向于与带有互补突变的抗体结合，形成稳定的异源二聚体。这种方法无需改动Fab臂，即可高效实现双特异性抗体的组装。
展望未来：双特异性抗体与癌症治疗
双特异性抗体作为极具前景的靶向药，其从实验室走向临床的每一步都离不开先进的抗体工程技术和高效的蛋白质纯化技术。前者确保了复杂分子的稳定高效生产，后者则保障了药品的高纯度与安全性。两者的深度融合，正不断降低双抗的开发风险，加速更多创新疗法惠及患者。
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参考文献：
1. Discovery and development of bispecific antibodies. Protein Expr Purif. 2025 Aug 5:236:106787
